مقدمه في مجال الميتاجينومكس

مقدمه في مجال الميتاجينومكس

| مقدمه

تدور الميكروبات حول العالم بكل بساطة. على الرغم من أننا لا نستطيع رؤيتهم عادة ، إلا أن الميكروبات ضرورية لكل جزء من الحياة البشرية – بل كل الحياة على الأرض – .  لا شك أن  كل عملية في المحيط الحيوي تتأثر  بقدرة الميكروبات التي لا نهاية لها . تُعد الكائنات الحيه الدقيقه احد اهم الكائنات التي تساهم في التوازن البيئي و ذلك لأن لها دور كبير في السلسلة الغذائية سواء كان هذا الدور مباشر او غير مباشر ، كما أنها تستطيع أن تعيش في كافه البيئات ؛ لذلك لا توجد بيئه تخلو منها ، كما أن لها قدره عاليه علي التأقلم ، حيث أنها تستطيع أن تعيش في مجموعات في تناغم تام و وصلت لدرجه كبيره من التناغم حيث أنها في بعض الأحيان تقوم بتبديل الماده الوراثيه الخاصه بها و نظراً لكل ذلك اهتم طائفه من العلماء بدراسه التغيرات و التطورات البكتيريه

و انقسمت هذه الطائفة إلى شقين

  • أحدهم اهتم بدراسه خصائصها الجينيه
  • و اهتم الآخر بدراسه تنوعها البيولوجي

و كان من اول العلماء الذين حاولوا فهم هذا العالم الملئ بالأسرار و الخبايا هو “فان ليفن هوك” التي كان مولعاً بالميكروسكوبات و صناعتها و ما الي ذلك و هذه الأبحاث و الدراسات ساعدتنا كثيرا علي عده مستويات و منها

  • تصنيع بعض المواد الكيميائية
  • تطوير تقنيات تنقيه المياه
  • تحسين نمو النبات
  • كما أنها ساعدتنا في تطوير تقنيات البيولوجيا التخليقيه
| الميتاجينومكس

 مجال الميتاجينومكس عباره عن مجموعه من التقنيات الحديثة و الأساليب التي تهدف إلى تحليل الجينومات الموجوده في مجتمع بكتيري معين دون الحاجة إلى تحليل عناصرها بطريقه متفرقه و هذا العلم يجمع بين علمين و هما

  • علم الأحياء الدقيقة “Microbiology”
  • علم الجينومكس “genomics “

تعتمد كثير من دراسات الميكروبيوم علي الميتاجينومكس والميكروبيوم هو دراسة المحتمع الميكروبي بالبيئه من حيث كل شئ حيث ان احدي جوانبه هي دراسة المحتوي الميكروبي من حيث الجينوم

من اهداف دراستنا لمجال الميتاجينومكس هي :

  • التصنيف الوظيفي المحتمل
  • التنوع التصنيفي للميكروبات الحاليه
  • اكتشاف ميكروبات جديده
  • المقارنه الوظيفيه من عينات مختلفه
  • معرفة العلاقات التطوريه بين الميكروبات في البيئه
  • معرفه اكثر عن الميكروبات التي لا تنمو في بيئات صناعيه (تستخدم في دراسات الميكروبيوم)

الميتاجينومكس لا يتبع الطريقه الكلاسيكيه التي يتبعها علم الأحياء الدقيقة حيث أن الميتاجينومكس يهتم بفهم تصرف البكتريا عن طريق عده خطوات و يستخدم الباحثون طرق عديده في مجال الميتاجينومكس و من هذه الطُرق ..

  • طريقه سلسله ال RNA الريبوزمي S16
  • طريقه السلسله الكامله للجينوم و ذلك عن طريق التقطيع العشوائي

(صوره توضح خطوات عمل الميتاجينومكس)

طريقة سلسلة الـ rRNA S16

تعتبر هذه الطريقه هي سبب انخراط العلماء في علم الميتاجينومكس ، يعود هذا الفضل الي العالم الأمريكي (كارل ويس) الذي استطاع أن يثبت أن بإمكاننا تصنيف الميكروبات تبعاً لصيغه جينات (rRNA) فقط ، و قام بذلك عن طريق تصنيف كلا من جين (S5) و (S16) مما سهل عليه القيام بتقديرعدد الفصائل الموجودة في عينه ما و لكن بعد ذلك تمكن العلماء من دراسه التنوع البكتيري بكفاءة عاليه و وقت أسرع و تكاليف أقل بسبب ظهور تقنيات جديدة مثل ال PCR

يتميز RNA S16 بأنه يتكون من نوعين من السلاسل : 

  • إحداهما ثابته و هي غالباً ما تكون مشتركة بين السلالات و تستخدم لتصميم بوادئ PCR
  • الأخرى متغيره “تختلف من سلاله لأخرى”

يجب الإحاطة بأن طول الجين S16 حوالي (bp 1500) و نظراً لهذة الرقم الكبير لا يمكننا تضخيمه كلياً في حاله استخدام آلات الجيل الجديد ؛ لأن أطول سلسله يمكننا سلسلتها تصل إلى 400 زوج ، أما في حاله استخدام طريقه سنغر يمكننا سلسله الجين بشكل كلي لكن نظراً لأرتفاع تكلفتها و بطئ وقتها لا تُستخدم هذه التقنيه

من مزايا S16 هي انه يوجد في جميع اوليات النواه مثل البكتريا , والوظيفه الخاصه به محفوظه لا تتغير ولكن قد يحدث تغير للتتابع الخاص به , وهذا مهم جدا في التطور , واخيرا هو ان طوله يصل الي (1500 bp) ولكن طالما يستخدم S16 في اوليات النواه , فماذا نستخدم في حقيقيات النواه , في الحقيقه ان حقيقيات النواه تختلف قليلا في هذه النقطه , حيث يستخدم منطقتان اخرتان وهم (الفاصل الداخلي القابل للنسخ ITS ) هو واحد من أكثر المتواليات شيوعًا لاستخدام الشفرات الرمزية في الفطريات , عادة ما يكون مختلف في الأنواع أو حتى العزلات (في بعض الأحيان) في نفس الجنس , ومع ذلك ، بسبب تقلبه العالي ، يختلف من الأصناف إلى الأصناف ، ولكنه مستقر بصفة عامة في نفس الجنس ، منطقة (ITS) هي منطقة الحمض النووي الأكثر تسلسلًا على نطاق واسع في علم الاحياء الجزيئي للفطريات ، وقد تم التوصية بها كمتسلسل ترميز عالمي للفطريات والمنطقه الاخري هي (18 sRNA) وهي الجين المترجم للريبوسوم حيث انه بما ان الريبوسوم عامل مشترك في كل الكائنات الحيه وبالتاكيد كان يؤدي وظيفته طوال الاف السنين ف بالتالي لم يحدث له تغير وظيفي حيث انه اذا حدث به تغير يؤدي الي عد قدرة الكائن علي تخليق البروتين وبالتالي موت الكائن الحي , لذلك يمكن استخدامه كشفره شريطيه للتعرف علي الكائنات الحيه بما انه منطقه محفوظه داخل الجينوم

(صوره توضح طريقة عزل S16)

| تحضير العينات و إستخلاص الحمض النووي

هناك جدال حول أفضل طريقه يمكن إستخلاص الحمض النووي من خلالها ، و لكن يجب الاتفاق علي أنه لا توجد طريقه إستخلاص (بروتوكول) تعمل بشكل جيد مع كافه العينات و لكن هناك بعض الخطوات المشتركه بين كل هذه الطُرق و منها  (التحليل الخلوي ، إزاله الشوائب، جمع ال DNA)

تأخد خطوه التحليل الخلوي الوقت الأكبر خلال عمليه الإستخلاص و ذلك لفصل الحمض النووي عن باقي مكونات الخليه ، كما تستخدم العديد من الدراسات مجموعه مختلفه من الوسائل الكيميائية و الفيزيائيه و الميكانيكية لفصل الماده الوراثيه ، و من الممكن استخدام الثلاث طُرق في التجمعات البكتيريه المعقده

بعد الانتهاء من خطوه التحليل الخلوي يتم فصل الشوائب – الجزيئات الغير مرغوب فيها – عن الماده الوراثيه ثم بعد ذلك يتم تركيز ال DNA في حجم مناسب لباقي التطبيقات و أثناء إستخلاص الماده الوراثيه و جمع العينات يجب مرعاه عدم حدوث تلوث لذلك يجب أن يعمل الباحث في أجواء خاليه تماما من الملوثات و يجب عليه أن يرتدي قفازات لمنع الميكروبات الخاصه به من الوصول إلى العينه لأن هذا يؤثر علي النتيجه النهائية

| السَلسله

بعد إستخلاص الحمض النووي نتطرق الي خطوه أخري و هي الحصول علي تسلسل من هذا الحمض النووي و في هذه العمليه هدفنا هو اكتشاف سلاسلات جديده و لذلك لا يمكننا الاعتماد الكلي علي شفرات الجينومات المرجعيه للكائنات الموجوده بالفعل في قاعده البيانات ، أصبح بإمكاننا الان في الميتاجينومكس أن نكسب الكثير من الوقت و نوفر المال و نحلل كميات كبيرة من الحمض النووي و ذلك عن طريق آلات الجيل الجديد للسَلسة ، عدا طريقه سنغر التي تستهلك الكثير من الوقت كما ذكرنا في السابق

و من آلات التي تُستعمل بكثره في عمليه السَلسلة

  • ABI solid
  • Pacific bioscience
  • Roche 454 Genome sequencer GS
  • Illumina

اولا يتم تحضير النموذج , والنموذج هنا يعني هي سلسلة من الحمض النووي تتكون من جزئين , الجزء الاول وهو الذي يلتحم مع البرايمر العام والجزء الثاني هو التتابع الذي نريد ان نعرفه وهذه المرحله مهمه لتحضير النموذج لنبدا بعد ذلك في سلسلة القواعد الخاصه بالعينه , ولكن قبل السلسله يجب اولا تضخيم او تضاعف الحمض النووي وهذا مايختلف تبعا لالة السلسله التي تستخدمها في التجربه كما سنري الان في الات (Roche 454) و الات (Illumina)

| الات Roche 454

تتم عملية تضاعف الحمض النووي باستخدام طريقة (emPCR) وهي طريقه مبينه علي نفس مبدا تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) حيث انه في البدايه تتم اضافة سلسلة (Adaptor) الي نهاية كل قطعه من الحمض النووي لتسهيل عمل البرايمر وبعد ذلك يتم الصاق جزء من هذه الجزيئات بكرات صغيره حيث كل كره تاخذ قطعه من الحمض النووي وبعد ذلك يتم وضع كل كره في قطرة ماء ومن ثم محلول زيتي لتصبح كل كريه مفصول عن الاخري وبعد ذلك تتم عملية التضاعف الطبيعيه بطريقة (PCR) حيث يتم رفع درجة الحراره لتفكيك السلاسل ومن ثم خفضها الخ ..

بعد تحضير الكرات يتم وضع كل كره في صفيحه تحتوي علي ثقوب بحيث يحتوي كل ثقب علي كره واحده فقط حيث يتم وضع هذه الكرات مع مجموعة كرات اصغر حجما تحتوي علي مركبات كميائيه تسهل عملية الاشعاع عند السلسله وتحليل الصور في كل مره ويتم بعد ذلك السلسله وقراءة نسبة الضوء لكل جزيء بعد حدوث عملية التهجين الذي يعمل بعد ذلك علي تحديد نوع النيوكليوتيد التي تم تهجينها

التضخيم وتحضير النماذج في آلات 454

| الات Illumina

الاختلاف هنا من حيث الطريقه ولكن المبدا واحد والهدف هو الاخر واحد , هنا يتم يتم استعمال صفيحة دعم صلبه تحتوي علي بوادئ اماميه وبوادئ خلفيه ويتم اضافة السلسله المراد معرفتها ولحمها بالبوادئ , حتي هنا حتي لو التصقت السلسله بالبوادئ لن يحدث شئ , لكن مايجعل السلسله  تبدا هي هي عملية رفع درجات الحراره فيحدث التصاق بالبادئ المقابل حيث تشكل مايشبه (الكوبري) وبعد ذلك سريعا يحدث انخفاض لدرجة الحراره لترتفع السلاسل مره اخري وتصبح قائمه غير منحنيه , خلال هذه العمليه تتم عملية السلسله والتي تقوم علي مبدا يتكون من ثلاثة مراحل وهي اضافة الجزئي القاعدي الذي سيرتبط بالجزء المقابل له في السلسله التي نريد معرفة تتابعها ومن ثم اخذ صوره لهذا التفاعل حيث تكون الاجزاء القاعديه المضافه معلمه بالوان مختلفه مشعه تكون معروفه لنا , وعند حدوث اشعاه باحد الالوان التي نعرف انها تتبع لاحد القواعد التي نعرفها نعلم انها التصقت بالقاعده المكمله لها في السلسله المراد معرفتها وتستسمر هذه العمليه وتتكرر عدة مرات حتي يكون لدينا اكثر من قراءه لنفس السلسله ليكون لدينا جوده جيده ولضمان القراءه الجيده

طريقة تضاعف النموذج من كرف شركة (Illumina)

هناك عده الآت أخري تُستخدم و لكن يتم اختيار التكنولوجيا المستخدمة تبعاً لنوع الدراسه واحيانا لتفضيل الباحثين

احد الات السلسله وتظهر الة (Illumina)

| تجميع السلاسل

في هذه العمليه يتم تجميع تسلسلات الحمض النووي إلى وحدات OTU ( التي تمثل وحده تصنيفه فعاله و هي اختصاركلمة ((operational taxonomic unit و يمكن تعريفها على أنها تحتوي على قدر كبير من التنوع )

الهدف في هذه المرحله هو تجميع السلاسل التي تحتوي على مناطق متشابهه و تحويلها إلى سلاسل أطول بهدف الحصول على السلسلة الكامله للجينومات المتواجده في العينه , كما تم تصميم عده خوارزمات للتقليل من الأخطاء الممكن حدوثها و تحديد عدد السلالات الموجوده بدقه (مثل de novo) و لكنها الي آلان لم تصل الي مستوي عالي من الدقه المطلوبه

كما أن هذه المرحله خطوه مهمه لتحليل التنوع بإستخدام عده طرق و منها استخدام المقاييس الايكولوجيه المستنده الي (OUT)، و لأن معظم الأنواع الميكروبيه لا يمكن ترتيبها في المختبر فلذلك تستند تقديرات التنوع بشكل عام إلى بيانات تسلسل الحمض النووي التى يتم تجمعها في وحدات(OUT)

| المقارنه مع قواعد البيانات

الان بعد ان قمنا بالسلسله والتجميع يجب علينا تعريف الانواع التي لدينا او بمعني اخر لدينا مجموعه من التتابعات ولا نعرف الي اي كائن تنتمي ونريد معرفة هذا التتابع يتبع اي كائن من الكائنات من الانواع التي تم عزلها ومعرفة تتابعها وسلسلته وتصنيفه واضافتها في قواعد البيانات ومعرفة اي كائن ينتمي

في هذه المرحله يتم عمل محاذاه بين التتابعات التي لدينا والتتابعات التي توجد في قواعد البيانات , حيث يتم تعريف الانواع عن طريق مطابقة التتابع الخاص بنا والتتابعات الموجوده بالقواعد , يجب ان نعلم ان التتابعات الموجوه بقواعد البيانات معروف الي اي نوع وكائن وصنف وجنس تنتمي اي انها معرفه تعريفا كاملا , واذا حدثت مطابقه بين التتابع الخاص بنا و احد التتابعات الموجوده في القواعد يتم تعرف هذا التتابع انه (س) وهذا تبعا لانه ياخذ اسم (س) في قواعد البيانات ويتم هذا مع جميع السلاسل الي ان يتم تعريفها جميعا , يحدث هذا عن طريق احد اهم واشهر برامج المحاذه وهو برنامج (BLAST) التابع لقاعدة البيانات الامريكيه (NCBI)

يسمح لنا (BLAST) بمطابقة السلاسل المتوفره في قاعدة بياناته فقط , لكن في بعض الاحيان وخاصة اذا كان لديك سلسلة فيرس انتشر مؤخرا او بعض العينات البكتيريه التي تريد ان تعرف هل تمت سلسلتها من قبل ومتوفره في قواعد البيانات ام لا , في هذه النقطه لا يستطيع (BLAST) ان يجيبك علي هذا السؤال حيث انه بعد ان يتم مطابقة السلاسل وتعريفها بالطبع يوجد بعض السلالسل لم تجد لها شريك ولن تتطابق مع السلاسل الموجوده في قواعد البيانات , يتم اعتبار هذه السلاسل علي انها (RAW sequncing data) ولا يتم التعامل معها او بمعني اخر ليس لها قيمه , ولكن في شهر فبراير من العام الجاري قام فريق من الباحثين بقيادة العالم (zamin lqbal) من المعهد الاوروبي للمعلوماتيه الحيويه (EMBL) بتطوير خوارزميه جديده للبحث في البيانات الخام (ملفات FASTAQ) للعينات البكتيريه , حيث اصبحت البيانات التي ليس لها قيمه قد تمكنك في اكتشاف نوع جديد من الميكروبات او معرفة تسلسل نوع غير موجوده تتابعه علي قواعد البيانات , تم نشر البحث في مجلة (Nature biotechnology)

| تحديد علاقات القرابه

يتمكن الباحثين في هذه المرحله من استنتاج العلاقات المتوارثة بين تسلسلات الحمض النووي و يتم ذلك إما بإستخدام قاعده بيانات مرجعيه مثل (SILVA) و ذلك عن طريق مقارنه المناطق المشابهه في الجينومات المتواجده ف العينه بالجينومات الموجوده في قاعده البيانات المرجعيه ، أو باستنباط نظريه النشوء بإستخدام أدوات مثل  (NAST) لمحاذاة التسلسل و(FastTree) لأستنتاج التطور من تتابعات الانحياز

و يستخدم  UniFrac), (phylogenetic Diversity)) علي نطاق واسع لإدراك السلالات العلميه التي تم التعرف عليها كما يستخدم احد اهم واشهر برامج بناء شجرة التطور (phylogenetic-tree) برنامج(megan) الذي سنخصص له مقال مفرد في المرات القادمه

صوره توضح (phylogenetictree)

الي هنا نكون قد انتهينا من هذا المقال , في المقالات القادمه باذن الله سنتحدث عن تحليل بعض البيانات في مجال الميتاجينومكس بشكل اكثر تفصيلا

  • | المصدر :
    Experimental and analytical tools for studying the human microbiome-
    16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Identification in the Diagnostic Laboratory: Pluses, Perils, and Pitfalls

Share this post

اترك تعليقاً

لن يتم نشر عنوان بريدك الإلكتروني.


Justin Pugh Authentic Jersey