تقنية (ChIP-seq)

تقنية (ChIP-seq)

| مقدمه

تعتمد العديد من العمليات الحيويه داخل الخليه الحيه مثل عمليات الاسكات الجيني وتنظيم التعبير وزياده انتاجيه الجين علي التفاعل بين الجينات والبروتينات المرتبطه بها سواء كانت بروتينات تساهم في عوامل النسخ وتنظيم التعبير أو البروتينات الهستونيه المرتبطه بالجينات والتي تتتيح لها اسكات جينات معينه عن طريق اضافه مجموعه ميثيل قبل الجين أو فتح الطريق لاخري لذلك كان من الضروري ان يتم الاهتمام بدراسه تأثير تلك البروتينات وتتابع الجينات المرتبطه بها ووظائفها الخلويه وبما أنها تختلف من خليه الي اخري (فمثلا الجينات المميثله في الخليه الكبديه تختلف عن تلك التي في خلايا الدماغ) فكان لابد أن نقوم بوضع تقنيه تتيح دراسه وتحليل تلك الجينات ودور البروتينات في تنظيمها ومن هنا جائت فكرة تقنيه الترسيب المناعي للكروماتين والتي تمزج بين تقنيات ترسيب البروتينات باستخدام الأجسام المضاده وبين تقنيات الجيل الثاني من السلسله لذا أولا دعنا نتعرف علي ماهيه تلك التقنيه وخطواتها

أتاح التقدم الأخير في منصات التسلسل (sequencing) شكل كبير من توصيف البروتينات المرتبطة بالحمض النووي على نطاق الجينوم باستخدام مزيج من المناعة وتسلسل الكروماتين الذي يسمي (ChIP-seq). التي تعتمد علي تفاعل الأجسام المضادة مع البروتين التي تتعرف عليه (antibody-antigen interaction)

على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من الطرق لتحليل ChIP-seq ، فقد تم وصف عدد قليل من هذه الطرق لمعالجة بيانات Chip-seq. لسد هذه الفجوة، نقترح تحليل مصممًا خصيصًا للكشف عن مواقع ربط البروتين بدقة عالية مثال (Regulators-epigenetics proteins)، و في ال Chip-seq نحلل أيضًا العلاقة بين عمق التسلسل وخصائص أوضاع الروابط المكتشفة ، ونوفر طريقة لتقدير عمق التسلسل الضروري لتغطية مطلوبة لمواقع ربط البروتين. باستخدام مجموعات البيانات التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا وهذا التحليل هو ChIP – Seq و هذا اختصار (Chromatin Immuno-Precipitation).

كما أن معدل أخطاء التسلسل يختلف بين القراءات المتسلسلة وداخلها، و هناك عده أسئلة تجيب عنها Chip-seq مثل , ما هو نطاق جودة علامة التسلسل الذي يجب التسامح عند محاذاة العلامات مع الجينوم المرجعي ؟ (و هذا في خطوة alignment) , ما هو توزيع علامات الخلفية المناسب لتقييم أهمية المواضع الملزمة الملاحظة ؟ ما هو العمق المطلوب للتسلسل؟ وكيف يمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد مواقع ربط البروتين بدقة؟

| نظرة عامة

و في هذا المقال سوف نتطرق الي عدة نقاط منها الخطوات الرئيسية للقيام بتقنيه Chip-seq

  • تثبيت الخلية
  • استخراج الحمض النووي
  • تقطيع الحمض النووي
  • ارتباط البروتين بالجسم المضاد
  • فصل البروتين عن الحمض النووي
  • سلسله الحمض النووي
  • تحليل البيانات

كما أننا  سنقوم بتوضيح المبدأ التي تعتمد عليه هذه التقنية، و مع كل خطوه سيتم توضيحها وصولا الي خطوة التسلسل (sequencing) و ادخال البيانات

الشكل العام لتقنية (ChIP-seq)

| اولا تثبيت الخليه

هناك نوعان أساسيان من عملية التثبيت بشكل عام:

  • التثبيت بالحرارة ويُستخدم هذا النوع بشكل روتيني مع البكتيريا والعتائق. وعملية التثبيت بالحرارة عادة ما تحتفظ بالمورفولوجيا العامة ولكنها لا تحتفظ بمورفولوجيا الهياكل الداخلية. وتعمل الحرارة على تغيير الخصائص الطبيعية الإنزيم الحال للبروتين ومنع التحلل الذاتي.
  • الغمر في هذه العملية يتم غمر العينة في مثبت بمقدار أكبر 20 مرة على الأقل من حجم العينة المراد تثبيتها

يتم تثبيت الخلية بعده طرق حيث أن هناك أكثر من طريقه التثبيت و منها

-المثبتات التشابكية ” ألدهيدات” مثل الفورمالدهيد الذي يضاف إلى العينة بنسبه  ما بين 3.7% و4% و ذلك لأنه يقوم بتثبيت المادة الوراثية بالبروتين المحيط به..

أو غلوتارالدهيد. وهو يعمل بطريقة مماثلة للفورمالديهايد

كما أن بعض بروتوكولات التثبيت تدعو إلى الجمع بين الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد بحيث تكمل قوة كل منهما الآخر ..

-المثبتات المرسبة ” الكحوليات” تعمل المثبتات المرسبة (المغيرة للطبيعة) من خلال تقليل قابلية ذوبان جزيئات البروتينات وغالبًا من خلال تعطيل التفاعلات الكارهة للماء التي تعطي الكثير من البروتينات بنيتها الثالثة. وعملية ترسيب وتجميع البروتينات هي عملية مختلفة بشكل كبير عن التشابك الذي يحدث مع مثبتات ألدهيدات. و من المواد المستخدمة في هذه العملية الايثانول و الميثانول و الأسيتون و حمض الخليك

-العوامل المؤكسده يمكن للمثبتات المؤكسدة التفاعل مع سلاسل جانبية مختلفة للبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى ، مما يتيح تشكيل تشابكات تعمل على استقرار بنية الأنسجة. ومع ذلك ، تسبب هذه المثبتات تمسخًا واسع النطاق على الرغم من المحافظة على نقاء بنية الخلية وتُستخدم بشكل رئيس كمثبتات ثانوية.

يمكن استخدام ثاني كرومات البوتاسيوم وحامض الكروم وبرمنغنات البوتاسيوم في بعض العينات كما أن رباعي أكسيد الأوزميوم يُستخدم في كثير من الأحيان

و يجب ذكر أن المثبت – بغض النظر عن نوعه- عاده يعمل علي تعطيل الجزيئات الحيويه مثل البروتين من الهضم و يعمل علي حمايتها

| ثانياً استخراج الحمض النووي

هناك جدال حول أفضل طريقه يمكن استخلاص الحمض النووي من خلالها، و لكن يجب الاتفاق علي أنه لا توجد طريقه استخلاص “بروتوكول” تعمل بشكل جيد مع كافه العينات و لكن هناك بعض الخطوات المشتركه بين كل هذه الطُرق و منها ” التحليل الخلوي ، إزاله الشوائب ، جمع ال DNA” و تأخذ خطوه التحليل الخلوي الوقت الأكبر خلال عمليه الاستخلاص و ذلك لفصل الحمض النووي عن باقي مكونات الخلية، كما تستخدم العديد من الدراسات مجموعه مختلفة من الوسائل الكيميائية و الفيزيائية و الميكانيكية لفصل المادة الوراثية ، و من الممكن استخدام الثلاث طُرق في التجمعات البكتيرية المعقدة بعد الانتهاء من خطوه التحليل الخلوي يتم فصل الشوائب –  كل الجزيئات الغير مرغوب فيها تُعد شوائب – عن المادة الوراثية ثم بعد ذلك يتم تركيز ال DNA في حجم مناسب لباقي التطبيقات و أثناء استخلاص المادة الوراثية و جمع العينات يجب مرعاه عدم حدوث تلوث للعينه لأن ذلك قذ يؤثر بالسلب علي التجربه ونتائجها

| ثالثاً تقطيع الحمض النووي

في هذه الخطوة هدفها الاساسي تكسير الحمض النووي الي قطع أصغر يبلغ طول القطعة الواحدة علي الأكثر 300 قاعده نيتروجينيه و تسمي هذه القطع باسم (fragments) و يتم تكسير الحمض النووي عن طريق عده طرق منها ال إنزيمات الهاضمة للحمض النووي أو عن طريق عمليه ال  (Sonication) و في هذه العملية يتم تعريض العينة الي اهتزازات و ترددات مرتفعة التي بدورها تؤثر علي ال DNA ف تكون سبب في تكسير الحمض النووي

| رابعاً ارتباط البروتين بالجسم المضاد

في هذه الخطوة يتم اختيار اجسام مضادة تتعرف علي البروتين محل الدراسة المرتبط مع الحمض النووي و هذه الاجسام المضادة مرتبطة سلفا ببروتين مرتبط بحبيبات مغناطيسية غير مسامية (Protein A/G bead) ، ولكن يجب مراعة التركيزات المطلوبة من الاجسام المضادة بالنسبة للعينة لأن إذا قلت نسبة الاجسام المضادة بالنسبة للعينة لن يتم التفاعل لكل كمية البروتينات المطلوبة و إذا ذادت النسبة بينهم قد تؤدي الي اشارة ضعيفة فيما بعد و يتم خلط عينة الحمض النووي المرتبط بالبروتين بالأجسام المضادة المختارة و يتم تركها فتره ما بين 6 ساعات ل 12 ساعة حتي تتفاعل و ترتبط بالبروتين و مرتبط بها المواد المغناطيسية ليتم الفصل عن طريق المغناطيسية في الخطوة التالية

| خامساً فصل البروتين عن الحمض النووي

في هذه الخطوة يكون هدفها الاساسي هو فصل مركب الأجسام المضادة المرتبطة بالبروتين المرتبط الحمض النووي عن الشوائب وايضا فصل البروتين عن قطع الحمض النووي عن طريق عملية لعكس التثبيت (Cross-linkage reverse) ليتم عمل عمليه سلسله للحمض النووي (sequencing).

و ليتم فصل المركب عن الشوائب  نعتمد علي الفصل المغناطيسي حيث يتم اضافة محلول يعمل علي جعل البروتين المتصل بالحبيبات المغناطيسية و ايضا بالأجسام المضادة معلق في المحلول في عملية تسمي إعادة تعليق (re-suspension) ، ثم يتم وضع مغناطيس خارجي لكي يتجمع المركب عند المغناطيس ثم يتم رمي المحلول و اضافة محلول لإعادة التعليق مرة اخري فيصبح لدينا مركب مكون من (البروتين A/G مرتبط بالجسم المضاد المرتبط بالبروتين الممسك بالحمض النووي).

ثم نريد عكس عملية تثبيت البروتين محل الدراسة بقطعة الحمض النووي عن طريق عملية عكس التثبيت التي ذكرناها (Reverse Cross-linkage) ، لكي تتم هذه العملية ، عن طريق حرارة مرتفعة و هاضم بروتينات كايه (Proteinase K) هذا المركب يشق او يكسر عند الجهة الكربوكسية للمركبات الأليفاتيه او الأروماتية او الكارهة للماء، و من ثم يحلل الهاضم البروتينات المرتبطة مع الحمض النووي و الاجسام المضادة لأنها مكونة من بروتينات فيصبح غير مرتبط بها ، ثم لكي نعزل البروتينات عن الحمض النووي نضيف فينول كلوروفورم (phenol-chloroform) و من ثم يتم غسلة بإيثانول (Ethanol).

| سلسلة الحمض النووي

عند الوصول لهذه الخطوة يصبح معنا قطع الحمض النووي فقط ، فنبدأ بعمل سلسلة لهذه القطع sequencing بالات السلسله للجيل التالي عن طريق تقنية (High-throughput bisulfite sequencing)

و من آلات التي تُستعمل بكثره في عمليه السَلسلة

  • ABI solid
  • Pacific bioscience
  • Roche 454 Genome sequencer GS
  • Illumina

هناك عده الآت أخري تُستخدم و لكن يتم اختيار التكنولوجيا المستخدمة تبعاً لنوع الدراسه واحيانا لتفضيل الباحثين

التحليل التجريبي لحالات مثيلة الحمض النووي معقد بسبب حقيقة مهمه وهي أنه لا يغير الاقتران الأساسي ويتم فقده (اي االميثله) أثناء تضخيم PCR.

تقليديًا ، اعتمد قياس السيتوزين الميثيلي بدلاً من ذلك على تفاعل كيميائي باستخدام درجة حرارة مرتفعة ، ودرجة حموضة منخفضة ، ومعالجة بسلفيت الصوديوم ، وهو بروتوكول يزيل السيتوزينات غير الميثيلية على وجه التحديد ويحولها إلى يوراسيل ، مع ترك السيتوزينات الميثيلية دون تغيير.

 يستبدل التضخيم PCR اللاحق للحمض النووي المحول ثنائي السلفيت اليوراسيل بالثيمين ، مما يؤدي إلى تعدد الأشكال للنوكليوتيدات المفردة الخاصة بميثيل والذي يمكن اكتشافه بالتسلسل التقليدي والمحاذاة مقابل التسلسل المرجعي.

(A) الخطوط العريضة العامة لبروتوكول إنشاء مكتبة RRBS بما في ذلك جميع الخطوات الأساسية
(B) نظرة عامة على RRBS قراءة المحاذاة
(C) تغطية متسلسلة في مناطق محددة من الاهتمام داخل جينوم الفأرة كما تم إنشاؤها من مكتبة خلية تمثيلية جذرية (ES)
لا يزال التسلسل بواسطة محلل الجينوم Illumina هو الخطوة الأكثر تكلفة في إنشاء ملفات تعريف المثيلة على نطاق الجينوم ، لذلك يجب توخي الحذر لضمان أن تكون المكتبات التي تم إنشاؤها بأعلى جودة ممكنة قبل إرسالها للتسلسل عالي الإنتاجية.
علاوة على ذلك ، إذا تم تجميع المكتبات الناتجة من عينات متعددة معًا ، فيجب أن تكون متشابهة إلى حد كبير في نطاقات الحجم والجودة لتوفير أعلى تمثيل ممكن للجزء المشترك لتسهيل المقارنة.
بشكل عام ، يوفر التحقق من صحة العينات بواسطة الفحص البصري مقياسًا دقيقًا للجودة ويضمن تغطية معقولة ضمن النطاق المحدد.

نكتفي بهذا القدر في هذا المقال لنتحدث في المقال القادم عن تحليل البيانات بعد خروج التسلسل من الات السلسله ..

| المصادر : ChIP, RIP, and Protein-Nucleic Acid Pull-Down Products 

Share this post

اترك تعليقاً

لن يتم نشر عنوان بريدك الإلكتروني.


Justin Pugh Authentic Jersey