الات الجيل الثاني من السلسله

الات الجيل الثاني من السلسله

| مقدمه

تحدثنا سابقا عن كيفيه سلسله ال(DNA) و الطرق المختلفة لسلسلته مرورا بتفاعل سانجر الي يومنا هذا .وقد حان الوقت للتحدث عن الانظمة و الاجهزة المختلفة (Platforms) المستخدمه في هذة العمليه والتي تتطلب الدقه والكفائة مع اعتبار عامل الوقت والتكلفة ضمن المتطلبات الاساسيه لتصميم اي نظام مع تحديد ايا من انواع الجينومات وحجمها سيتم العمل علي سلسلته لذلك ومنذ عام 2000 ومع انتهاء مشروع الجينوم البشري human genome project الذي اظهر للعالم مدي تعقيد الجينوم البشري واهميه معرفه تسلسله صار من الضروري علي كبري الشركات في هذا المجال تطوير اساليب وطرق احدث للتغلب علي مشاكل السلسله التي واجهت العلماء في المشروع وعلي مر السنين وفتح ابواب جديده لفهم طرق التعبير الجيني في مختلف الكائنات لذا دعنا اولا نلقي نظرة سريعه علي كيف تطورت تلك النظم في عشرين عاما مضت لتصبح اكثر كفائه في تحليل الجينوم ومعرفه خصائصه ..

| صعود ال platform

منذ بدايه مشروع الجينوم البشري اتجهت انظار الشركات الي التطوير والبحث في هذا الاتجاه حتي تصبح السلسله اكثر دقه واقل في الوقت والتكلفة مع خفض معدل الخطأ الي اقل ما يمكن
ويبدو ان عام 1998 كان عاما ذهبيا بالنسبه الي تقنيات السلسله فبدأُ من تأسيس شركه illumena علي يد ديفيد والت David R. Walt ومرورا بابتكار تقنيه الـ (Solexa ) في نفس العام والتي فيما بعد ستشتريها شركة illumena مقابل 600 مليون دولار ..
وفي مقال نشر في جريدة الـ (nature) يوضح كميه المخرجات output منذ عام 2000 الي عام 2010 ويمكن القول بأن عام 2000 كان البدايه الحقيقيه لتنافس الشركات الكبري في تطوير طرق وتقنيات السلسله حيث شهد دخول شركة roche الي سوق الجينوم عام 2000 مع جهاز ( Benchtop Sequencer)
وقد اوضح المقال التزايد الطفري للمخرجات بين عامي 2005 الي 2006 و خاصة مع شراء شركه( illumena ) لشركه (solexa) مما اسهم في تطوير تقنيه السلسله وخفض تكلفتها من 3 بليون دولار في مشروع الجينوم البشري ثم الي الـ مليون دولار في سنه 2007 الي 4000 دولار في عام 2013 والان ونحن في عام 2019 تصل التكلفه الي 1000 دولار فقط ونلاحظ كذلك وصول المؤشر الي اقصي ارتفاعه عام 2009 و 2010 مع اصدار شركة (illumena) احدث اصداراتها آنذاك وهو (hiseq 2000) وكذلك مع تطور تقنيات شركة SOLiD عام 2008 .وبدايه تطوير وقيام شركات اخري مثل (ION torrent )

صوره توضح تغير تكلفة الجينوم علي مدار الوقت من خلال تطوير التقنيات

مما سبق يتضح التسارع الملحوظ في تطوير تقنيات وطرق ومنصات السلسله يوما عن يوم مع اختلاف اهداف السلسله من حيث ال (rna) او اجزاء الـ dna او حتي exome , فيما يلي نستعرض اهم الفروق بين منصات وطرق السلسله ..

| illumine

تأسست شركه (illumena) عام (1998) علي يد ديفيد والت الباحث الذي طور تقنيه ال (microarray) عملت الشركة علي تطوير تقنيات السلسله والكشف عن النشاط الجيني وتخفيض تكلفه التقنيات المتعلقه بهم حتي عام 2006 وشراء (illumena) شركة (solexa) للسلسله التي تأسست علي يد (David Klenerman) وكان قد ابتكر الاخير تقينه (sequencing by synthesis) وكان لشراء شركة ايلومينا التقنيه وتطويرها مساهمه كبيرة في تخفيض تكلفة السلسله كما ذكرنا من قبل وبعد تلك السنه اصدرت illumena عدة اصدارات كان اخرها ( the one-cubic-foot iSeq 100 sequencer) , الان علينا ان نعرف كيف تعمل الان الومنيا ..

في البدايه علينا ان نعرف ان مراحل سلسله اي جينوم هم اربعة خطوات اساسيه ..
• تحضير العينه sample preparation
• انتاج التجمعات cluster generation
• السلسله sequencing
• معالجه البيانات والمخرجات data collection and analysis

1- تحضير العينه : تبدأ المرحله الاولي بتقطيع الـ (DNA) الي قطع واجزاء اصغر عن طريق انزيمات القطع restriction enzyme ومن ثم نقوم بفك شريطي الـ (DNA) واعداد الشريط الاصلي باضافة بوادئ primers في كلا طرفيه لاستخدامه في المرحله التاليه
2- انتاج التجمعات : يتم اضافه الشريط الاصلي من الـ (DNA) الي مصفوفة معده سابقا تحتوي علي بوادئ الدنا الموضوعه في كلا طرفيه علي شكل مصفوفات , يلتصق شريط الـ (DNA) علي سطح الشريحة ومن ثم تلتف قطعه الدنا ليرتبط البادئ بالبادئ الذي يكمله في عمليه تسمي ب  amplification bridge مما يسمح لانزيمات البناء المضافه علي العمل واكمال شريط مكمل بعد ذلك .ينفصل الشريطين ونقوم بغسل المصفوفه لاستبعاد الشريط الاصلي والاكمال مع القالب واكرر العمليه حتي احصل علي الشريط الاصلي في المصفوفة مع عدد كبير من النسخ منه لاستخدامها في


3- السلسله : نقوم باضافه بادئ مكمل للبادئ الامامي –الغير مرتبط بالشريحه – وتبدأ انزيمات الربط والبناء polymerase في بناء نيوكلوتيدات دنا معلمه di-nucleotide بجزيئات تعطي اشارات ضوئيه خاصة بكل نيوكلوتيده عند اتحادها مع الشريط الاصلي تقاس تلك الاشارة علي مستقبلات خاصة وتسجل علي قاعدة البينات . لاستخدامها في جمع وتسجيل البيانات وتسجل علي قواعد خاصه مثل (base space sequence )
تحتل ايلومينا المركز الاول عالميا وسط شركات السلسله وذلك تبعا لتقرير نشر في (genengnews) حيث وصلت ايراداتها عام 2017 الي 2.8 مليار دولار وتبعا للموقع فان ذلك يعود الي اخر اصداراتها التي يعتبر تحديا بتكلفة تصل الي 19.900 دولار والذي يعمل بتقنيه (CMOS)
وعلي الرغم من مميزات ايلومينا التي تكمن في الوقت اللازم لاجراء السلسله (يوم – يومين علي الاكثر ) وكفائتها العاليه في قراءة التتابع بشكل صحيح مع ارتفاع معدل انتاجيتها بالاضافه الي كبر حجم المساحة المسموحة بالقراءة فانها تحتوي علي نسبه خطأ تصل احيانا الي 0.1 وذلك لان التقنيه المستخدمه في قراءة نهايه التتابع احيانا لا تكون دقيقه بنسبه كبيرة – تم تداركت الشركه المشكله مؤخرا واستحسانها في اصداراتها الجديده

|شركه SOLiD

هي واحدة من اشهر منصات السلسله علي مستوي العالم قام بتطويرها George m church من جامعه هارفرد ثم تم اعادة تطويرها واطلاقها عام 2008 و تعتمد في اصلها علي طريقة سلسله المستعمرات (polony seq) وهي طريقة فعاله جدا ماديا حيث تبلغ تكلفتها حوالي 0.13 دولار لكل مليون قاعدة وان احتوت علي بعض الاخطاء التي سأذكرها لاحقا ولكنها تظل فعاله بشكل ممتاز لكن كيف تتم ؟ تتم سلسله الدنا علي منصه SOLiD من خلال طرق مختلفة في اعداد المستقبلات التي سترتبط بالدنا عند سلسلته وتتفق في خطوات اعداد العينه وتحضيرها

1- اعداد العينه : تبدأ تلك الخطوة بتقطيع الدنا الي اجزاء اصغر من خلال اكثر من تقنيه اما كيميائيا عن طريق انزيمات القطع البكتيريه والتي تستهدف اماكن محددة ومعروفه ..او فيزيائيا من خلال موجات الالترا سونيك ultra sonic التي تستخدم لاستحداث فقاعات غازيه في العينه وتقطيع الدنا من خلال الرنين والاهتزاز او من خلال تقنيه الرزاز(nebulization) التي تستخدم الضغط لاجبار محلول الدنا علي المرور من خلال ثقب صغير في جهاز مخصص لهذا وتكون فعاله جدا في كميات الدنا القليله بالاضافة الي تقطيعها الدنا الي اجزاء صغيرة جدا من 700-1300 قاعدة , بعد ذلك يتم اضافة المحولات (adapter) الي العينه وتكون عبارة عن نوعين مختلفين من المحولات علي طرفي الدنا وتنتهي الخطوة الاولي بفك شريطي الدنا واختيار شريط قالب ليكمل عمليه السلسله

2- مضاعفة الدنا : بعد فك الشريطين يتم اضافه جزيئات يحتوي سطحها علي مستقبلات ترتبط بالمحول الاول علي عينه الدنا الجاهزة حيث يرتبط كل جزيئ واحد بمحول واحد فقط ومن ثم بقطعه دنا واحدة فقط لا ترتبط كل الجزيئات بالمحولات لكن تظل نسبه 80% منها حرة لذلك يلزم اضافه جزيئات اخري ترتبط بالمحولات علي الطرف الاخر –الحر- من الدنا ومن ثم نقوم بالطرد المركزي ونستخدم الراشح الذي يوضع في شريحه خاصه له مع قواعد دنا حرة وانزيم الربط ويترك ليتم تضاعف الدنا وفي نهايه الخطوة يكون علي كل جزيئ ملايين من نفس قطعة الدنا التي بدأنا بها ..

3- الخطوة الثالثه : توضع الشريحة في جهاز التسلسل وتبدأ عمليه السلسله اما عن طريق اضافه بادئ و قواعد معلمه بصبغه ضوئيه تقرأ اشارتها بعد ذلك علي مستقبلات خاصه تحولها الي بيانات او من خلال اعداد (probe) يحتوي علي 8 قواعد ..قاعدتين مختلفتين معملتين مع 16 احتمال لانتاج لون فمثلا (ثيامين وادنين ) ينتجان اخضر اما (ادنين وجوانين ) لونا اصفر وهكذا .. وثلاث قواعد عالميه يمكنها الارتباط ب ايا من القواعد الاربعه وثلاث قواعد اخري تحذف بعد غسل العينه ترتبط بصبغه تعطي اشارة بناء علي القاعدتين الاوليين , و بعد ارتباط البروب بالدنا تعطي اشارة تقرأ علي مستقبل مرتبط بقاعدة البيانات ثم يغسل الوسط وتحذف القواعد الثلاث الاخيرة وتظل تلك العمليه حتي نهايه قطعه الدنا وبنهايه تلك الدورة تفك الشريطين وتتكرر العمليه مع عدد اقل من القواعد العالميه ..

4- معالجة البيانات : تتم معالجة البيانات علي كلاسترات خاصه كما في الحالات السابقه وان كان معدل الخطأ في سوليد اقل مما يمكن فانها تحتوي علي نسبه خطأ في سلسله القواعد المتناوبه – القواعد التي تقرأ من اتجاه 3-5 وتقرأ بنفس الكيفيه في الشريط المكمل 5-3 وذلك لاحتماليه تكوين الهيربين (hairpin ) بين طيات الدنا اثناء عمليه السلسله ولا يقرأ هذا الجزء

| PacBio

تعتمد تلك المنصه علي تقنيه zmw وهي تعتمد علي تصميم شريحة من خلايا ذكيه تحتوي علي انزيم بلمرة وبناء الدنا (dna polymerase) مثبت في قاع الخليه بالاضافه الي حساسات ومستقبلات خاصة بداخل طبقه القاع لقراءة الطول الموجي الصادر عن الاشارة التي تنتجها قطع الدنا المعلمه التي يقوم انزيم البلمرة بربطها في الشريط الاصلي ومضاعفته .تتصل تلك الخلايا الذكيه بكلاسترات لتجميع البيانات وتحويلها الي صورة رقميه يمكن قرائتها بشكل جيد علي حواسيب متخصصه , تتصدر المنصه الترتيب السابع عالميا حسب الاحصائيه السابقة وذلك لانها شهدت تطورا في ايراداتها في خلال الثلاث سنوات الماضيه مع دخولها الي اسواق جديدة في السلسله كسلسلة جينومات النبات والحيوان

| ion torrent

استحوذت شركه life technology عام 2010 علي شركة ايون تورينت لتوسيع اسواقها في البحث العلمي وطرق السلسله حيث كانت شركة ايون تورينت تعملي علي تقليل الوقت والتكلفه اللازمين لاجراء عمليه السلسله فوصلت في اصدارها بي جي ام 3 الي 99 دولارا فقط في خلال ساعتين ..لكن كيف تختلف تلك التقنيه عن سابقيها ؟
تعتمد تلك التقنيه في تحضير العينه علي نظام الجزيئات التي تحتوي علي مستقبلات اعلي سطحها كما في تقنيات سوليد لكن تختلف عنها في طرق السلسله والقياس حيث تتم تعبئة العينه علي شرائح خاصه لقياس مد التغير في محتوي البي اتش مع اضافه نوع معين من النيوكلوتيدات فمثلا في اول دورة نقوم باضافه قواعد الادنين فقط الي الشريحة ومن ثم تبني فقط قواعد الادنين اذا كانت في اول التتابع وبالتالي يتم اطلاق بروتون الي الوسط مما تستقبله الحساسات الخاصه لهذا وتحوله الي بيانات وتكرر الدورة مع نوع اخر من القواعد بعد ازاله محتوي الادنين من الوسط , في بدايه ظهور تلك التقنيه كانت تظهر انخفاضا ملحوظا في سلسلة سلاسل الرنا والايكسوم واليمتاجينوم لكن في نهايات 2015 اصدرت الشركة اصدارا جديدا اظهر تحسنا ملحوظا في سلسله تلك السلاسل

| oxford nanopore

تأسست الشركة عام 2005 علي يد (هاغان بايلي) و(سبيك بيلكوكس) وتم تطويرها عام 2012 وعام 2017 كانت من ضمن اكثر 10 شركات تطورا في مجال سلسله الجينوم واعتمدت فكرتها في الاساس علي مرور الدنا من خلال ثقب نانوي اما ان يحتوي علي مستقبلات وحساسات الكترونيه او بروتينيه او دمجا بينهما كالتالي حيث تعتمد فكرة الثقب علي اختلاف احجام القواعد مما يؤدي الي مرور ايونات بتركيز مختلف لكل قاعدة ومازالت التقنيه قيد التطويرومن مميزاتها هي عدم الحاجه الي تفاعل البلمرة (بي سي ار) لان التقنيه تعتمد علي شريط واحد فقط من الدنا فلا حاجه لزيادة عدد الدورات او غيرها , بالاضافه الي الدقه الكبيرة في تحليل البيانات وسلسله التتابع مع اختصار الوقت الذي قد يصل احيانا الي سلسله في نفس اليوم في احدي تطبيقاتها وهو (العلامات الفوق جينيه للخلايا الورميه) ليس هذا فحسب انما ايضا يمكن اعتبار انها تمتلك عددا كبير من انواع العينات التي تستطيع سلسلته مثل (epigenetics , genome , metagenome) صوره 6
بعد ان تعرفنا علي المنصات والشركات المختلفة التي تعمل في مجال سلسله الدنا حان الوقت لملخص بسيط عن اهم الفروق والاختلافات بينهم صوره 7
منذ بدايه مشروع الجينوم البشري تسابق العلماء من مختلف انحاء العالم لتطوير هذه التقنيه بمختلف الاساليب للحصول علي دقه تصل الي 99% في قراءة محتوي الجينوم ليس البشري فحسب لكن لمختلف الكائنات وبيان الفروق والاختلافات بينهم كما شهد العالم في الخمس سنوات الماضيه تطورا ملحوظة في هذة التقنيات بالاضافه الي انخفاض تكلفتها بشكل كبير وذلك سيؤدي لاحقا وفي وقت ليس ببعيد الي العديد من التطورات في مجال الطب الشخصي وفهمنا الاعمق ليس فقط لتاريخ وجودنا علي الارض وعلاقتنا بالكائنات الاخري ولكن ايضا الي كيفيه تفاعل الجينات في الكائنات الاخري ومن الممكن عما قريب ان نضع حلولا لمشاكل لازال العالم يشكو منها لتنير ظلمته في المستقبل القريب ..

Share this post

اترك تعليقاً

لن يتم نشر عنوان بريدك الإلكتروني.


Justin Pugh Authentic Jersey